作为当今最主流的基因编辑系统，CRISPR-Cas9在癌症、遗传病治疗以及动植物基因研究中都有着巨大的应用潜力。虽然可对DNA进行特定切割，具有靶向修饰效率高、多靶点编辑和编辑RNA的独特优势，但CRISPR/Cas存在明显的缺点：如果靶基因附近没有PAM（Protospacer Adjacent Motif）则无法实现编辑，同时还面临脱靶效应问题。

脱靶效应是影响基因编辑技术能否广泛应用的主要限制因素，如何正确评估、检测脱靶效应，并提出相应的策略降低脱靶效应，是当前基因编辑研究领域的重要研究方向之一。已有研究显示，全基因组测序法是检测脱靶效应最简单有效的方法之一。2015年，韩国生命科学技术研究院科研团队曾在Nature Methods发表研究性文章“Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells”，强调了全基因组测序在鉴定CRISPR-Cas技术脱靶效应中的关键作用，并首次提出Digenome-seq的概念。

图1.文章发表在Nature Methods

近期，韩国同一科研团队在Nature Biotechnology发表了基因编辑最新研究成果，利用DNBSEQ-T7平台（华大智造）完成了基于Digenome-seq测序的CRISPR- Cas12f1脱靶效应验证。研究人员通过对gRNA进行个性化改造，构建了一种高效、特异的基因组编辑工具——CRISPR-Cas12f1。DNBSEQ-T7全基因组测序数据证实，该系统特异性高、脱靶位点明显减少。当利用AAV载体传递时，CRISPR-Cas12f1系统能够实现多路复用和高效的基因组编辑。

CRISPR/Cas脱靶效应的高低关键之一在于gRNA设计，如果gRNA和非目标区域有过多的非特异性结合，会导致脱靶效率较高。因此，gRNAs的设计和改造有助于提高CRISPR工具在简便性、多路复用、特异性等方面的能力。研究团队为了优化Cas12f1的gRNA，利用已有gRNA改造的背景知识，在tracrRNA和crRNA序列中确定了5个潜在的修饰位点（MSs）进行改造，最终获得了一个强大的、非常紧凑的CRISPR-Cas12f1系统。数据显示，工程改造gRNAs可使得大多数靶基因位点indel频率显著增加，其中一条gRNA诱导的平均效率甚至提高了867倍。

图3. gRNA总体改造策略，来源: Nature Biotechnology

除了Cas12f1的紧凑性外，该系统对基因治疗还有一个额外的优势：可以诱导dsDNA在原间隔序列外的分裂。这一特性意味着，即使在第一轮介导的indel突变之后，原始间隔层序列也可能保持不变，dsDNA裂解过程可以继续进行。

考虑到Cas12f1在细胞中的持续活性，因此检测CRISPR-Cas12f1系统的特异性尤为重要。研究团队使用Cas-OFFinder（一种潜在脱靶位点预测算法）鉴定了潜在脱靶位点，发现在目标位点和基因间区域Cas12f1具有更高的靶内效率。

研究人员探索了AAV与CRISPR-Cas12f1在治疗方面的功效，对c.2991+1655A>G突变位点两侧进行检测时发现了一对强效sgRNA。利用该sgRNA构建了携带Cas12f1系统的AAV载体，并评估比较了Cas12f1在HEK293T细胞中诱导缺失的效率。发现Cas12f系统导致的缺失水平较高，Cas12f1基因缺失率较对照组高约46%。表明Cas12f1可能为基因治疗提供一个多功能、有效的基因组编辑系统。

图5. CRISPR-Cas12f1可与AAV进行整合，来源: Nature Biotechnology

在这项最新研究中，华大智造DNBSEQ-T7出色完成了全基因组测序任务。研究人员根据测序数据得出了关键结论之一：CRISPR-Cas12f1系统脱靶效应更低，表明DNBSEQ-T7测序仪性能稳定，可产出高质量全基因组测序数据。

准确无误的全基因组测序数据是得出正确结论的关键，而高质量测序数据主要得益于建库和稳健高效的测序仪。华大智造于2018年推出的超高通量基因测序仪DNBSEQ-T7可支持全基因组测序，具有高达6Tb的日常数据输出能力，可在一天内完成多达60例人类全基因组测序。上述研究结果表明，DNBSEQ-T7测序平台能够提供高质量全基因组测序数据，用于基因编辑结果检测、特异性和脱靶效应鉴别等。