国家疾控中心领衔，基于DNBSEQ多平台联合发表猴痘病毒快速测序策略

导读：

猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）是一种长度为197kb的双链DNA病毒，由大约200个基因组成，可在人类和野生动物中引起疾病。近年来，人类猴痘病例逐渐增多，已成为全球关注的焦点。

核酸扩增和血清学检测能以低成本快速诊断猴痘病例，但这些检测不能用于监测MPXV的来源、谱系、传播和基因组变异。新出现的变异可能会使得样本中的病毒载量被低估，甚至导致误诊。为了更好地开展MPXV感染的预防和治疗，有必要制定具有成本效益和高质量的MPXV全基因组测序策略。

近日，来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、重庆市疾病预防控制中心、华大智造等单位的研究团队在Virologica Sinica期刊发表了题为“Rapid identification of full-length genome and tracing variations of monkeypox virus in clinical specimens based on mNGS and amplicon sequencing”的文章。研究团队利用多种测序平台对获取的猴痘病例样本开展了mNGS（宏基因组测序）和扩增子测序及对比分析，并对这些平台的周转时间和所需成本进行了估算。研究显示，采用华大智造研发的DNBSEQ-G99进行扩增子测序的覆盖率达99.66%，能够对临床样本进行快速测序，从而促进获得高质量的MPXV基因组序列。

值得注意的是，该研究采用了DNBSEQ-G99测序平台具备的多时点数据输出模式（Bioanalysis by Sequencing, BBS），可在2小时内完成初始数据处理并给出分析报告，在12小时内获得完整病毒基因组，大大缩短了MPXV测序所需的时间，具有成本效益和高效率。BBS技术由中国疾病预防控制中心与华大智造联合研发，并于2021年公布。

文章发表在Virologica Sinica

多种策略结合获取MPXV基因组信息

MPXV基因组测序的主要策略是宏基因组和扩增子测序。MPXV只占临床样本总DNA的一小部分（不到1%），为了对MPXV基因组进行测序，必须从临床样本中分离病毒并进行培养，然后再进行基因组测序。病毒分离耗时且需要严格的条件。相反，扩增子可用于富集或扩增病毒核酸。在这项研究中，研究团队利用宏基因组和扩增子测序方法来准确鉴定MPXV的完整基因组。扩增子测序成本低和效率高，使得临床样本能够快速测序，从而有助于获得高质量的MPXV基因组序列。

扩增子测序

在扩增子测序中，使用ATOPlex平台对猴痘参考基因组（NC_063383.1）设计PCR引物（含739对扩增子，扩增子长度：313-395bp），并进行猴痘病毒的基因组扩增，使用MGIEasy Fast PCR-Free FS DNA library Prep Kit制备扩增子测序文库，在DNBSEQ-G99平台上采用SE100+10+10测序策略对文库进行测序。

宏基因组测序

在mNGS中，完成测序文库制备步骤后，将制备的DNB加载到规则阵列载片上，在华大智造测序平台DNBSEQ-G99（BBS模式，PE100+10+10）和DNBSEQ-G400*（PE100+10+10）上进行测序。

BBS技术助力快速生成高质量MPXV基因组

在传染病防控中，特别是未知病原体的鉴定，时间至关重要。研究团队估计了上述分析所需的时间。对比周转时间，在扩增子测序及分析中， DNBSEQ-G99为12小时；

在mNGS中，DNBSEQ-G99为12小时。在扩增子数据集中， DNBSEQ-G99的10×覆盖率最高，为99.66%，在mNGS数据集中，DNBSEQ-G99、DNBSEQ-G400*测序水疱液样本的10×覆盖率最高分别为99.93%、99.99%。

DNBSEQ-G99的多时点数据输出模式（bioanalysis by sequencing, BBS)，可缩短交付时间，该系统可在运行后2小时内完成初步分析，并在12小时内完成PE150测序，新技术的应用大大缩短了MPXV测序所需的时间，在极致快速的基础上更快一步，且测序读长不受限，更加适用于公卫系统紧急多元的检测场景。对于病毒载量较低的口腔拭子样本（Ct=27.81），也能够在12小时内获得完整的病毒基因组序列。

总体分析来看，DNBSEQ-G99的耗时短，覆盖率高，reads数量大，可满足MPXV基因组测序需求。考虑到成本，研究团队认为，mNGS适用于对疱液等高病毒载量样本进行测序，其应用于口咽拭子等低病毒载量样本会导致成本过高。扩增子测序是提高基因组质量同时显著降低费用的一个有效方法。

值得一提的是，在该研究中，研究团队采用DNBSEQ-G99成功地对2022年9月中国内地报道的第一例输入性猴痘病例以及2023年6月初发现的一例病例进行了突变分析，并对病毒基因组进行了溯源分析。2022年9月，刚刚发布的华大智造基因测序仪DNBSEQ-G99，首次应用于传染病防控，助力该次溯源测序得到了高度可信的毒株序列全长。

结语

该研究表明，目前的主流测序平台能够满足MPXV全基因组测序的要求，并准确识别样本中的基因组变异位点。病毒感染样本测序策略的选择应结合样本数量、预期持续时间和成本等因素仔细考虑。对于高病毒载量的样本，如水疱液，mNGS和扩增子测序都可以产生高质量的全长病毒基因组。对于病毒载量较低的样本，如口咽拭子，由于需要大量的测序数据，因此不建议直接进行mNGS，成本较高，扩增子测序可高效地对临床样本进行测序且成本较低。

研究团队将各种新的测序技术与扩增子富集策略相结合。即使对于低病毒载量的口腔拭子样本，也能使用DNBSEQ-G99在运行后2小时内完成初步分析，在12小时内获得完整的病毒基因组序列，大大缩短了MPXV测序所需的时间，为监测变异和对MPXV等重要病原体发出早期预警提供了重要帮助。

针对新发未知病原体的快速识别和溯源需求，华大智造基于自主研发的试剂、仪器和软件打造了病原微生物高通量测序产品组合，覆盖从样本到报告输出全流程，是猴痘病毒识别和溯源的理想工具。该产品组合可兼容DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25、MGISEQ-200和MGISEQ-2000等测序仪, 文库制备与数据分析均实现了自动化操作。华大智造独有的DNBSEQ技术，为病原体的识别和溯源保障高质量的测序数据。

华大智造病原微生物测序产品组合

1.扩增子测序方案

ATOPlex多重PCR技术开发的猴痘病毒扩增子测序Panel，含739重PCR引物，覆盖病毒全长基因组，可对病毒进行相对定量，用于猴痘病毒的快速鉴定和溯源。

MPXV分析软件具备猴痘病毒的鉴定，变异检测以及株系分型等功能，能够快速、准确的对测序数据进行分析。

2.mNGS方案

使用MGIEasy Fast FS DNA Library Prep set对样本进行文库制备，通过高通量测序技术，可以对样本中未知病原进行鉴定和溯源。

PFI分析软件可以对未知病原进行快速鉴定，MGAP分析软件，可以对病原进行基因组组装等分析。

靶向测序（Targeted Next-Generation Sequencing，tNGS）因其针对特定基因或基因区域进行深度测序的能力而备受关注。tNGS主要分为基于引物 PCR扩增的扩增子测序和基于探针杂交的杂交捕获测序两种方法。

病原靶向测序（tNGS）在病原微生物检测上比较热门，主要是将多重PCR扩增与测序技术结合，能够对待测样本中几十种至几百种病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测。

华大智造ATOPlex平台采用自主研发的单管超高重PCR技术，可提供个性化的多重PCR引物池，以及包括对应的扩增体系在内的一整套靶向建库试剂。在靶向测序方面，表现出优异的性能，现已全面覆盖DNA、RNA和甲基化靶向捕获三个方向，适用于分子育种、遗传病研究、公共卫生等多种方向的应用。

* 本文部分转载自测序中国；点击文末“阅读原文”，查看文章链接

* DNBSEQ-G400，国内产品名为MGISEQ-2000