2013年世界动物卫生组织（WOAH）成立高通量测序（HTS）、生物信息学和计算基因组学（BCG）特设小组，2016年该小组发布了首个在兽医学中应用高通量测序技术的通用标准1并收录于《陆生动物疫苗和诊断手册》。10年后的今天，高通量测序技术已发展得相当成熟，国产高通量测序平台愈发经济和便捷，大大加快了该技术在兽医学中的使用。

图1 《陆生动物疫苗和诊断手册》第1.1.7 章提到的高通量测序的应用方向1

华大智造DNBSEQ测序平台已在畜禽疾病诊断、疫病监测、致病机理研究、耐药性分析等相关工作中得到应用，给兽医临床工作带来了重要提升与改善。现将相关应用案例总结如下，以帮助兽医工作者了解高通量测序技术，更好地利用该技术改善动物疫病的诊断、控制和管理。

我国畜禽养殖场动物疫病呈现多发、混合感染状态，快速、全面、准确地鉴定病原体是及时制定有效防控措施、减少疾病传播和损失的关键2。传统检测方法往往针对单一靶标或3-4个多重靶标进行检测，在进行批量样本、多病原检测时，操作复杂、耗时长、综合成本较高。

靶向测序通常用于检测与临床疾病相关的已知病原体，单次检测靶标数量远大于PCR方法，获取的信息更多。除了鉴定病原，还能表征其特点耐药、毒力基因、分型、区分疫苗株/野生株等特点，非常适合混合感染及综合征的检测3。

图2 ATOPlex单管超高重PCR技术特点与原理

华大智造推出病原微生物靶向测序产品组合，基于ATOPlex多重PCR技术开发了靶向测序Panel，搭配华大智造DNBSEQ测序平台和分析软件，实现从样本到报告的全流程支持，具有数据质量优异、基因组覆盖全、自动化程度高等特点，为病原微生物的监测与溯源提供强大工具。

中国农业大学动物医学院王少林教授基于华大智造病原微生物靶向测序产品组合开发了猪呼吸道病原体靶向测序Panel。此Panel针对常见的引起猪呼吸道感染的15种病原体（7种病毒、4种细菌、4种其他病原体）的多个保守区域靶标基因开发而成，覆盖病原种类丰富，特异性好，适用于鼻拭子、咽拭子、血液血清及组织样本。

图3 采用猪呼吸道靶向panel对猪场真实样本的检测结果

针对有呼吸道感染症状的猪，单次检测可以有效检出猪蓝耳病病毒、圆环病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等多病原混合感染。

细菌耐药性日益成为全球关注的重大健康威胁，遏制抗生素耐药性需要联合人类、动物、环境卫生和其他相关学科和部门的专家共同参与。近年来由于抗菌药物的不合理使用，动物源耐药菌/耐药基因广泛流行与传播，养殖环境已成为耐药菌/耐药基因的主要贮库与来源之一。

王少林教授团队基于华大智造病原微生物靶向测序产品组合同时开发了耐药基因多重扩增子测序Panel4。此Panel针对278种抗生素耐药基因、重金属耐药基因以及遗传移动元件设计了超多重扩增子，可以同时检测上千个耐药基因及其变异体，适用于极低起始量样本。相比宏基因组测序方法，靶向测序能够检出更多靶标基因。对于一些丰度较低的耐药基因，靶向测序灵敏度更高，同时能以较低的测序成本实现靶标基因测序深度的显著提高与高覆盖率。

图4 奶牛养殖场耐药基因多重扩增子检测及细菌分录验证结果

利用耐药基因多重扩增子测序方法，研究者对多个奶牛养殖场的健康、患病个体，以及粪便、土壤、垫料等环境样本进行了调查。通过检测，在环境样本中发现了多种抗生素耐药基因，主要包括β-内酰胺类抗生素耐药基因、AmpC头孢菌素酶耐药基因、超广谱β-内酰胺酶耐药基因和碳青霉烯类耐药基因。进一步验证发现，5个奶牛场中健康奶样、临床乳房炎样品中均检测到β-内酰胺酶，环境和皮肤拭子样本中均分离到产β-内酰胺酶细菌，与环境样本中检测到β-内酰胺酶耐药基因的结果一致，据此推测原奶样本中的超广谱β-内酰胺酶可能来源于环境中的产β-内酰胺酶细菌。因此需要更加关注环境中的耐药菌可能带来的食品安全的问题。

监测预警体系是应对突发疫情防控的基础，随着非洲猪瘟、新型冠状病毒肺炎和新发人兽共患病的出现，全球现有的动物疫病监测预警体系面临新的挑战。相比传统的分子基因分型方法，如多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）等，全基因组测序（WGS）技术获得的疫病信息更加全面，通过从基因组水平对分离株之间的单核苷酸变化或多态性进行分析，识别高度相似甚至相同的分离株，以确定爆发源和追踪传播。

图5  2018年8月3日至9月2日中国境内非洲猪瘟病毒感染农场的位置图及ASFV 基因组序列的系统发育关系5

非洲猪瘟病毒于2018年8月传入中国，在短短几个月内迅速扩散至全国，至2019年7月底，全国31个省份暴发非洲猪瘟疫情150起，其中家猪暴发146起，野猪暴发4起，对全国生猪养殖造成极大破坏。获取在中国流行的非洲猪瘟病毒株的全基因组序列并深入研究其特征，对疫情控制、疫苗研发意义重大。

中国动物卫生与流行病学中心研究人员基于华大智造DNBSEQ测序平台，对直接从现场样本中分离的China/2018/AnhuiXCGQ非洲猪瘟毒株进行了全基因组测序，获得了该毒株基因组的完整编码序列区，并进行了深入的基因组变异分析。

基因组序列比对分析显示，China/2018/AnhuiXCGQ毒株与其他基因型II强毒株之间存在54-107个变异位点，导致10-38个基因中氨基酸残基的表达或改变。China/2018/AnhuiXCGQ毒株与POL/2015/Podlaskie毒株具有最高的相似性。基于125kb长的保守中心区的系统发育分析显示，China/2018/AnhuiXCGQ毒株和四个欧洲基因型II菌株被分为三个集群。这项研究为非洲猪瘟病毒的进化提供了重要信息，也为疫苗和诊断试验的开发提供了基本信息。

高通量测序技术作为一种研究工具已经在兽医学中广泛应用，并且正在逐步被纳入兽医诊断实验室，但作为兽医诊断工具大规模使用，仍需要完善多方面的工作。如：面对不同场景选择全基因组、宏基因组和靶向测序等不同方法。测序实验室必须在质量体系下运作，并对指定用途的测试进行系统验证，计算分析的灵敏度和特异性、准确度、精确度和检测限。需要合适的专家对序列数据进行分析3。数据的解读应由具有适当资格的兽医主导，并符合动物疾病诊断的标准要求等1。

图6 华大智造MGI iLab智惠实验室

华大智造提供MGI iLab智惠实验室，覆盖从样本存储及前处理、文库构建与高通量测序、数据分析储存以及全流程闭环管理，为您的兽医测序实验室提供标准化、模块化、自动化、信息化、智能化的平台工具支撑。

【参考文献】

1. CHAPTER 1.1.7.STANDARDS FOR HIGH THROUGHPUTSEQUENCING, BIOINFORMATICS AND COMPUTATIONAL GENOMICS.

2. WU G，WEI J T，ZHANG Y X，et al． Application of the high－throughput sequencing technology in veterinary clinical practice ［J］．Animal Husbandry ＆Veterinary Medicine，2021，53 ( 1) : 130－135．

3. Wilkes, R. P. Next-Generation Diagnostics for Pathogens.Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 39, 165–173 (2023).

4. Li, Y. et al. Multiplexed Target Enrichment Enables Efficient and In-Depth Analysis of Antimicrobial Resistome in Metagenomes. Microbiol Spectr 10, e02297-22 (2022).

5. Bao, J. et al. Genome comparison of African swine fever virus China/2018/Anhui XCGQ strain and related European p72 Genotype II strains. Transbound Emerg Dis 66, 1167–1176 (2019).