RNA是生物学分子机理研究中不可避免需要使用到的研究对象。细胞内的RNA蕴含着丰富的信息，包括序列、丰度、结构等。由于RNA表达具有时间和空间的特异性，样本获取难度较大，取材后样本中RNA的精准分析显得尤其重要。华大智造目前已发布四款基于MGI测序平台的RNA建库试剂盒，本次将重点介绍MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒。

目前主要的RNA研究策略包括转录组测序（mRNA），长链非编码RNA测序（lncRNA），小RNA测序(small RNA)和环状RNA测序（circRNA）等。华大智造已发布四款基于DNBSEQTM技术并与MGI测序平台适配的RNA建库试剂盒（表1）用于实现RNA的系统化研究。

前期我们已介绍了MGIEasy RNA文库制备试剂盒（可点击此链接或文末链接查看）[刘致恒(zhihe1] ，本期着重介绍MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒。对比常规RNA分析，方向性RNA测序分析在构建测序文库时，将RNA链的方向信息保存到文库中，测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链，这一方法更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现反义转录本以及更多新的基因，是研究基因结构和基因表达调控的重要手段。简单的说，RNA方向性转录组测序就是高阶版本转录组测序，能够帮助生物狗更加精准分析基因转录表达信息。

那么MGIEasyRNA方向性文库制备试剂套装的表现究竟如何呢？让我们一一道来。

1.起始量可低至10ng

图1（左） 不同起始量PCR产量     图2（中） 不同起始量比对率     图3（右） 不同起始量基因检出数

用商业化标准品UHRR（Universal Human Reference RNA，Agilent，740000）进行测试，total RNA投入量分别为10ng，50ng，200ng和1μg，OligodT磁珠钓取polyA RNA后，采用MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装建库，结果显示，文库产量与1ug达到同等水平，基因比对率达到60%左右和基因检出数接近20000个，不同起始量不存在显著差异。即使当投入量低至10ng时，本试剂盒保持稳定高质量数据产出，能够解决生物狗珍贵样本分析的老大难问题，使得即使只有10ng total RNA的珍贵样本也依然可以保持高质量数据产出。

2. 基因表达定量精准，重复性好

同样是UHRR钓取polyA RNA后，采用MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装构建库，结果分析显示，在基因定量准确性上，MGIEasy RNA方向性文库与qPCR的一致性为0.86，与MGIEasy RNA文库（采用MGIEasy RNA文库制备试剂套装建库）的定量一致性达0.99以上，三次样本测试重复性可达到0.99以上。

图4（左） MGIEasy RNA方向性试剂盒与qPCR定量一致性  图5（ 右）MGIEasy RNA方向性文库与MGIEasy RNA文库定量一致性

3. RNA结构分析更直接可靠

MGIEasyRNA方向性文库制备套装在结构分析上到底有哪些优势呢？首先是能准确定向RNA转录的方向，如图6所示，MGIEasyRNA方向性文库检测到正链的比例可以达99%。

图6 RNA方向性试剂盒与RNA试剂盒的正链比例

由于MGIEasy RNA方向性文库能够定位RNA转录的方向，所以在相同Reads深度的覆盖下，MGIEasy RNA方向性文库能更准确的确定Junction形成的位点，对于转录本结构检测及变异分析更有助益。

图7 RNA方向性试剂盒相比RNA试剂盒进行转录本结构检测的优势

4. 更完美的基因覆盖度

与I平台的同类型主流试剂盒的文库数据相比，MGIEasy RNA方向性文库具有更完美的基因覆盖度，能均匀覆盖基因5’端到3’端（图8），那么在转录本组装等方面就具有更多优势。RNA方向性试剂盒不仅在结构分析和基因表达定量分析上的双重优势，而且让基因检测更准确。

图8 RNA方向性试剂盒与I平台的主流试剂盒的均一性比较

RNA方向性试剂盒在基因结构分析和基因表达定量分析上的双重优势，让基因检测更准确。

当然，我们也不能只看MGISEQ平台上比较数据，为了分析不同测序平台之间是否存在显著性差异，我们也进行了I平台的主流试剂盒（N和K）数据一致性分析，结果显示与N试剂盒的一致性为0.95，与K试剂盒的一致性为0.98（图9）。整体上来说平台之间，不同试剂盒之间具有可比性。

图9 RNA方向性试剂盒与I平台的主流试剂盒的一致性

下面快速总结一下华大智造不同试剂盒以及使用范围，提供给各位生物狗们选择，让大家不要为了宝贵样本数据产出发愁。

以上试剂盒中，rRNA去除试剂盒是一款高效的RNA富集试剂盒，能有效去除rRNA，保留mRNA，lncRNA和circRNA。另外一种常见的RNA富集方法，是通过OligodT磁珠钓取具有polyA尾巴的mRNA和部分lncRNA，这种方法已有很多成熟的商用试剂盒。Total RNA样本经上述任一种富集方法处理后，即可结合MGIEasyRNA文库制备试剂盒套装或MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒套装进行文库构建并进行后续测序。

此外，关于small RNA文库制备试剂盒介绍请点击这里，这个可是华大智造测序平台上的王牌应用之一，在超过100篇文章中已经被验证和使用。

最后，奉上MGIEasy RNA方向性文库制备试剂盒实际数据供测评练手，请戳这里→

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048125/CNR0066420/

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048127/CNR0066422/

参考文献：

[1] Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., & Pandolfi, P. P.(2011). A ceRNA Hypothesis: The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language?Cell, 146(3), 353–358.

[2] Kallen A N, Zhou X B, Xu J, et al. The imprinted H19 lncRNAantagonizes let-7 microRNAs[J]. Molecular cell, 2013, 52(1): 101-112.

[3] Jin X, Feng C, Xiang Z, et al. CircRNA expressionpattern and circRNA-miRNA-mRNA network in the pathogenesis of nonalcoholicsteatohepatitis[J]. Oncotarget, 2016, 7(41): 66455.