随着新冠病毒的全球肆虐，如何在针对疑似样本的大规模检测中，既能提高检测灵敏度，又能获得完整的病毒全基因组序列以用于后续变异监测和研究？近日，中国科学家预印在bioRxiv的一篇文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》给出了答案。

研究采用宏基因组测序（Meta）、探针捕获测序（Capture）和多重PCR扩增子测序（Amplicon）三种方法分别对8例梯度稀释的病毒培养物（Ct值17.3-39.9）和8例新冠病毒临床样本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液样本）基于DNBSEQ平台进行了检测。其中，采用宏基因组方法对临床样本进行了超高通量测序，每个样本产出数据大于300Gb，但在总Reads中的病毒Reads仅占0.002%-5.513%；而采用探针捕获测序方法和多重PCR扩增子测序方法则能将这一比例提高数十至数万倍。除此之外，研究团队还从不同方法对样本数据量的要求、不同病毒载量检测灵敏度及突变检测准确性等多方面展开了进一步的对比和分析。

样本数据量要求

在同时满足全基因组覆盖度95%以及10X测序深度的情况中：针对8例病毒梯度稀释样本(102-106 copies/ml)进行探针捕获测序需要5.3Mb-14Gb数据，进行多重PCR扩增子测序需要33Mb-973Mb数据；针对8例临床样本，进行探针捕获测序需要12Mb-25Gb数据，进行多重PCR扩增子测序需要32Mb-1.8Gb数据，而宏基因组需要129Mb-334Gb数据。

表1 在10X测序深度下三种方法所需要的数据量 (全基因组覆盖度95%)

在满足高质量下游分析的情况下(捕获≥20X，多重≥100X，宏基因组≥10X，覆盖度≥95%)：针对8例病毒梯度稀释样本(102-106 copies/ml)的探针捕获测序需要8Mb-24Gb数据，多重PCR扩增子测序需要185Mb-2.7Gb数据；而针对8例临床样本的探针捕获测序需要23Mb-25Gb数据，多重PCR扩增子测序需要261Mb- 1.8Gb数据，而宏基因组则需要129Mb-334Gb数据。

表2 满足深度分析要求的三种方法所需要的数据量

通过以上对比可知，在低病毒载量样本中，多重PCR扩增子测序方法所需数据量最少，而且在不同病毒载量样本中所需要的数据量差异较小。

病毒载量检测灵敏度

在DNBSEQ平台，采用华大智造SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel试剂盒，对梯度稀释的病毒培养物（Ct值17.3-39.9）和临床样本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液样本）分别进行检测，结果表明：对于高病毒载量（≥105 copies/ml），探针捕获测序和多重PCR扩增子测序都有很好的富集效果（平均每个样本相对于宏基因组方法分别获得了5596倍和5710倍富集）；而在低病毒载量的样本中（≤104 copies/ml，Ct值≥28.7）多重PCR扩增子测序的富集效果是探针捕获测序的10-1000倍。这一结果表明，在低病毒载量的情况下，多重PCR扩增子测序具有更好的检测灵敏度。

#RPM-每M数据中病毒read的数量 图1 三种方法对病毒富集的效果

突变检测准确性

针对8例临床样本，研究发现，基于多重PCR扩增子测序和宏基因组测序方法都可以检测到19个突变位点，而探针捕获测序只能检测到18个位点，漏检一个点，并且该位点对应的样本病毒载量低（Ct 值30）。这一结果表明：多重PCR扩增子测序方法相对更为准确，特别是在样本病毒载量极低的情况下。

图2 三种方法突变检测结果

结论

综上，基于高通量测序技术的三种方法在新冠病毒检测的应用中，可供参考的建议如下：

1. 如果研究人员希望研究包括目标微生物在内的所有可能感染的病原微生物，而样本病毒载量≥105 copies/ml或Ct值≤ 24.5，推荐宏基因组测序方法；

2. 如果研究人员只针对目标微生物展开探讨，而且面临的样本比较具有挑战性，譬如病毒载量<105 copies/ml或Ct值>24.5，那么：当研究人员较为关注的是次要碱基突变和碱基频率时，推荐探针捕获测序方法；当研究人员较为关注的是主要碱基突变时，则推荐多重PCR扩增子测序方法；

3. 如果研究人员只针对目标微生物展开探讨，关注的重点是主要碱基突变，而且面临的样本极具挑战性：病毒载量低至102 copies/ml或Ct值高至35，推荐多重PCR扩增子测序方法。

目前，针对以上三种方法，华大智造DNBSEQ平台均已推出配套整体解决方法。特别地，在该文中采用的SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel试剂盒基于华大智造ATOPlex多重定制化服务平台打造。该试剂盒除了应用于全基因组组装、病毒变异检测、进化研究外，还能够应用于极端新冠样本的检测，最低仅需1M Reads就可获取病毒全基因组信息，其表现出比常规RT-PCR更高的灵敏度，能够满足RT-PCR假阴性样本的二次检测、复核确诊和大规模疑似样本检测的需要。

关于SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel试剂盒

• 基于华大智造ATOPlex多重定制化服务平台打造的定制Panel；

• 基于锁定引物的2步PCR，特异性强，中间不需要额外的消化步骤，操作简单；

• 能够在一管中实现病毒全基因的扩增，不需要分管操作；

• 加入已知拷贝数人工合成外参DNA，并同时进行病毒基因和外参DNA的检测，用于病毒的载量确定；

• 加入看家基因检测，可以用于病毒载量相对于细胞含量的确定，有助于病毒细胞病理学研究；

• 双唯一Barcode结合DNBSEQ测序，最大程度地降低了Barcode串扰，降低了在大规模平行测序过程中强阳性样本对弱阳性或阴性样本的污染。

关于ATOPlex多重PCR定制化服务平台

ATOPlex多重PCR定制化服务平台是华大智造自主研发的以超高重PCR技术为核心的产品定制平台。该平台涵盖了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可以满足科研、医药、司法、农业、DTC等相关领域的个性化基因检测产品定制。ATOPlex多重PCR定制产品平台提供产品设计、建库试剂。此外，还可以提供定制化产品基于MGISP-100或者MGISP-960的自动化建库解决方法。