利用荧光标记方法通过DNA点阵成像获取碱基信号，是高通量测序技术的关键步骤之一。华大智造近期重磅发布的CoolMPS高通量测序试剂套装却颠覆过往，开创性地推出了基于抗体的测序试剂产品，它使用的dNTPs 未在碱基上标记荧光。这一创新，可以实现无损碱基识别，能够让碱基识别更为清晰。这一测序试剂套装也即将于圣诞节正式开售。

那么，它的诞生将带来哪些独具一格优势？ 它的数据表现如何？

一、优势特点：信号强、天然、效率高

信号强、天然及效率高可以概括地反映CoolMPS高通量测序试剂盒的特点及优势：

首先，它信号强，每个抗体能标记多个荧光，碱基信号更强。每个抗体分子可以标记上多个荧光分子，相同拷贝数的DNB，用CoolMPS可以获得更高的信号和更高的信噪比，从而使测序更准确。图1显示了在多个循环中使用两种测序化学的强度比较，CoolMPS产品信号强度远高于传统高通量测序试剂产品。

图1 测序时CoolMPS的信号强度及随循环数的变化趋势

其次，它没有非天然碱基带来的荧光淬灭，因为荧光分子标记在抗体上，测序过程中无多余化学键的残留。在传统的高通量测序方法中，聚合的碱基上会留下多余的化学键，即“疤痕”（图2），这可能会影响待测碱基上的荧光信号，进而影响测序的准确性。CoolMPS方法中新合成链的碱基为天然碱基，不会因为碱基上的疤痕而影响荧光信号，最终获得更高的准确性和更长的测序读长。

图3展示了CoolMPS测序中，前两个碱基对被测碱基信号的影响。碱基上不存在任何疤痕，不论前面两个碱基是什么，其A、C、G、T的信号均相当稳定。

图4展示了CoolMPS的测序错误类型与前一个碱基的关系：无论前一个碱基是什么，CoolMPS的测序错误都非常低，且没有明显的错误偏好。

图2 CoolMPS与传统高通量测序方法的比较：无疤痕

图3 CoolMPS测序中，前两个碱基对被测碱基信号的影响

图4 CoolMPS与StandardMPS的比较：前两个碱基对被测碱基信号的影响

再者，它的反应更完全，即DNA聚合天然碱基的效率更高。聚合酶结合及新加的都是天然碱基， DNA聚合酶在生物体内的底物是天然dNTPs。 虽然经过突变体的改造，DNA聚合酶也能加碱基上有庞大荧光基团标记的dNTPs，但其反应效率远远不如加碱基上没有标记的dNTPs。此外每一轮反应接近100%的完成率也是进行长读长测序的必要条件，否则信号会呈现指数下降，产生测序错误。

测序时，常用lag及run on指标来反映反应是否完全。lag是指测序进行到N位置时，其某些拷贝才反应到N-1位置的比例；而runon则指某些拷贝已反应到N+1位置上的比例。我们测定了用于CoolMPS的测序酶在加100%的有荧光标记碱基的dNTPs与加无修饰碱基的cold dNTPs的lag与runon，其结果如图5所示，加cold dNTPs的平均lag值（0.2%）比加荧光标记dNTPs的平均lag值（0.7%）低很多。同时，加cold dNTPs的平均runon值（0.06%）比加荧光标记dNTPs的平均Runon值（0.24%）低很多。CoolMPS技术的低lag及低runon可能使得测序读长更长。

图5 DNA聚合酶对Cold dNTP与Labeled dNTPs的聚合的lag和runon的效率比较

应用数据展示

1. CoolMPS PE100测序数据产量及Q30表现优异

CoolMPS与StandardMPS的PE100测序在WGS(PCR)、WGS(PCR-Free)、WES、RNA-Seq和Panel等应用上的数据显示：CoolMPS的数据产量比StandardMPS高6%，且Q30%比StandardMPS高1~9%。

图7 CoolMPS PE100数据产量和数据质量表现（Demo数据）

2. 应用数据表现：外显子、肿瘤Panel、RNA-Seq

针对三种不同的应用数据，结果显示CoolMPS测序数据的clean rate和mapping rate表现良好，且覆盖度均一；CoolMPS检测频率准确，且与理论频率的相关性更高。

-外显子

样本：NA12878

建库：MGIEasy 外显子捕获V5探针试剂套装

测序平台：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长：PE100（CoolMPS PE100试剂）

测序结果：

对4个NA12878样本的WES数据截取100X平均深度的数据，采用MegaBolt软件进行了同步分析比较，如表2和图10所示，CoolMPS测序数据的clean rate和mapping rate表现良好，且覆盖度均一。

表2 CoolMPS的WES分析结果

图8 CoolMPS与StandardMPS的WES数据比较

-肿瘤：

样本：FFPE标准品Horizon HD200

测序平台：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长：PE100

测序试剂：CoolMPS & StandardMPS

测序结果：

CoolMPS与StandardMPS检测频率均准确，CoolMPS检测与理论频率的相关性更高。

表3 CoolMPS与StandardMPS的肿瘤数据比较

图9 CoolMPS与StandardMPS的肿瘤数据比较

图10-1 StandardMPS与理论的突变检测频率的的相关性

图10-2 CoolMPS与理论的突变检测频率的的相关性

-RNA-Seq：

样本：UHRR标准品

建库：MGIEasy RNA方向性文库制备试剂套装

测序平台：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

测序读长：PE100

测序试剂：CoolMPS & StandardMPS

图11 CoolMPS，StandardMPS及N 平台与qPCR的相关性

CoolMPS，StandardMPS及N 平台与qPCR的相关性，Spearman r=0.866，高度一致。

图12 CoolMPS，StandardMPS及N 平台的相关性

不同方法或相同方法测序重复性均大于0.99。

三、 CoolMPS的测序原理

大家也许对CoolMPS的测序原理依然充满好奇，它实质上可以理解为联合探针锚定聚合技术（cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis，或称为StandardMPS）的升级版，它使用的核苷酸是碱基上未标记荧光的dNTPs（cold dNTPs）。在DNA聚合酶的作用下，cold dNTPs被聚合到测序链，然后通过和与此cold dNTPs特异结合的荧光标记的抗体（图13）来实现碱基识别。再生后，抗体从测序链上掉落，测序链上新加入的碱基完全是天然的碱基，没有任何修饰，如此循环往复，完成对DNA的测序（图14）。

图13 CoolMPS测序原理

图14 CoolMPS测序时，抗体分子与碱基的结合

    拥有如此多优点的CoolMPS 高通量测序试剂套装将于今年圣诞节12月25日正式开售，欢迎您一同探索它的奇妙与不凡！