Science | 华大智造测序平台助力解析植入后胚胎发育过程

2019年11月，由昆明理工大学灵长类转化医学研究院主导，深圳华大生命科学研究院等单位合作完成的最新研究成果“Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture”在国际著名学术期刊《科学》（Science）上在线发表。

文章利用单细胞测序技术解析了灵长类胚胎着床后特别是原肠运动时期重要的分子与细胞生物学事件，这对研究发育、衰老、人类疾病等领域有重大的推动作用。其中，华大智造DNBSEQ? 平台技术为研究提供了高质量的工具支撑。关于其原理优势，此前已有文章表明DNBSEQ? 在针对单细胞的SNP calling等方面具有明显优势。

单细胞测序技术的发展日新月异，催生了诸多领域突破，华大智造近期发布的 “可以装进口袋的单细胞实验室”——DNBelab C系列产品也为单细胞文库制备提供了便携式、即时化、一站式的工具支撑。搭配华大智造测序平台及单细胞分析软件，就可以完成单细胞组学研究全流程。

研究摘要

灵长类胚胎早期着床后发育是哺乳动物发育的里程碑事件，然而这一阶段也是胚胎发育研究中最不清晰的时期之一。本研究成功实现了食蟹猴胚胎体外20天培养，并通过对受精后9到20天的体外培养胚胎进行观察，发现体外培养胚胎呈现出与体内发育胚胎高度一致的形态学与基因表达特征。

本文利用单细胞测序技术对体外培养7个时间点的胚胎细胞进行测序，发现与体内发育胚胎细胞高度类似的分化与基因表达轨迹。该研究第一次利用体外系统，解析了灵长类胚胎着床后特别是原肠运动时期重要的分子与细胞生物学事件。研究结果有助于加深人们对早期着床后胚胎发育的理解，对于细胞替代性治疗及器官再生研究也具有指导意义。

研究方法

灵长类动物受精卵发育第7-20天变化

（备注：EPI:外胚层PE: 原始内胚层TE: 滋养层AMEC: 羊膜上皮细胞PGC: 原始生殖细胞 EXMC：胚外间充质细胞GAS：原肠胚细胞）

部分结果展示

本研究对食蟹猴胚胎体外培养系统进行了优化，使其能够在体外培养20天，通过下图1可以观察到20天内细胞团（ICM）细胞不断增殖形成盘状结构。

图1 食蟹猴胚胎体外培养系统（A:第7-20天观察的胚胎形状；B:胚胎盘长度；C: 第15天和第17天体外培养胚胎的绒毛样本结构，箭头表示绒毛状结构）

通过免疫组化的方法分析体外培养的胚胎在不同时期蛋白表达相关情况，培养胚胎呈现出了与体内发育胚胎高度一致的形态学与基因表达特征（图2、图3）。第14天开始，在羊膜中出现T+/SOX17+/TFAP2C+细胞（图2），这些都与体内发育胚胎表达情况一致（图3），揭示了羊膜上皮是潜在的原始生殖细胞起源地。

图2免疫荧光染色结果（体外培养胚胎第13、14、16、17天，箭头表示羊膜内的原始生殖样细胞；短箭头表示外胚层下方的原始生殖样细胞）

图3原始生殖细胞mark gene表达情况

单细胞转录组和染色质可及性分析

本文利用单细胞测序技术对体外培养7个时间点的胚胎细胞进行测序（第9、11、13、15、17、19和20天），通过t-SNE降维分析, 下图A鉴定出四组细胞（分布来自外胚层(EPI)、原始内胚层(PE，VE/YE)、滋养外胚层(TE)和胚外间充质(EXMC)，这些细胞与体内鉴定的细胞类型相同。

下图C、D是滋养外胚层(TE)分化轨迹：从第11天开始TE细胞逐步分化，随着CDX2表达的减少，TE细胞被分为两种类型，表达高水平TCEAL4的细胞可能是滋养层细胞（CTS），表达高水平GCM1的细胞可能是合胞滋养层细胞（STS）。这个结果证实了小鼠中公认的滋养层干细胞标志物CDX2在灵长类早期胚胎发育中表达并不能维持。

下图E是原始内胚层(PE，VE/YE)细胞的发育轨迹，可分化为两个细胞簇。细胞簇1和细胞簇2分别表达高水平的apoa2和cxcr4。

下图F其中细胞簇1表达与脂代谢、转运的基因，而细胞簇2主要表达介导转录和蛋白质合成的基因。

下图G是外胚层EPI细胞簇的分化轨迹，EPI-A和EPI-B与体内早期EPI细胞簇在一起，EPI-C与体内晚期EPI簇在一起，Gast与体内原肠胚细胞簇在一起。

讨论

灵长类动物早期胚胎发育与人高度相似，但对于灵长类动物着床后胚胎发育的研究依然难以开展，人力物力花费巨大。

为了深入探索灵长类胚胎着床后发育过程中的分子机制，本研究实现了食蟹猴胚胎体外20天的培养，培养胚胎呈现出了与体内发育胚胎高度一致的形态学与基因表达特征，但是体外培养胚胎的结构最终在20天左右崩溃，需要进一步改进培养参数以实现更长时间的体外胚胎发育。

体外培养的食蟹猴胚胎细胞进行单细胞组学分析滋养外胚层、多能外胚层、原始内胚层转录组谱，发现外胚层（epiblast）细胞在分化中的细胞亚型与状态变化，并揭示了氧化磷酸化途径在na?ve多能性维持中的作用；证实了体外分化的原始生殖细胞样细胞与体内原始生殖细胞在转录组水平的高度类似性。通过对细胞配体和受体基因表达的分析，揭示了外胚层、多能外胚层、原始内胚层谱系细胞间的互相作用关系，例如FGF和WNT通路在谱系分化中的重要作用。

体外培养胚胎开辟了一个崭新的研究平台，有助于深入了解灵长类动物早期发育过程中的动态分子和细胞变化，同时结合细胞追踪技术和单细胞测序技术，将有助于确定细胞发育分化的规律和途径。该研究工作首次利用体外系统，揭示了植入后早期非人类灵长类动物胚胎发生的关键发展事件和复杂的分子机制，有助于对人类早期着床后胚胎发育的理解。