赋能科研 | 基于DNBSEQ-E25测序平台，中国农业大学郑浩团队揭示蜜蜂肠道菌定殖的分子机制

近日，来自中国农业大学郑浩课题团队联合清华大学邢新会教授、张翀教授团队、华大智造研发团队，在微生物学领域知名期刊Microbiome（IF= 19.4）上发表了题为“Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis”的论文1，该研究利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术，构建了地熊蜂(Bombus terrestris)肠道细菌Snodgrassella的突变体文库。

通过在无菌蜜蜂模型体内的连续传代，追踪了Snodgrassella菌株的适应性定殖过程，观察到定殖能力增强的菌株在mglB基因中表现出显著的遗传变化，暗示其通过改变肠道菌IV型菌毛依赖性运动系统促进肠道菌的体内定殖。该研究中，针对单点突变位点的扩增子测序工作基于华大智造DNBSEQ-E25平台完成，以用于快速高通量检测肠道细菌的群落组成。

背景介绍

宿主肠道环境通常会对微生物带来较强的选择性压力，促使细菌保持特定性状以成功定殖，从而在长期共生过程中形成宿主特异性。识别宿主选择的特征对于理解动物和共生微生物之间不断发展的相互作用过程至关重要。

然而，当前的实验方法主要集中在模式细菌上，如高突变大肠杆菌或通过宿主传播而发生遗传变化的野生菌株，无法全面揭示肠道微生物定殖和宿主特异性形成的过程，此研究利用ARTP诱变技术突破自发突变率低的限制，以便在温和条件下研究肠道细菌的分子进化机制。

研究成果

01

ARTP诱导的特定突变可能导致Snodgrassella在非本地宿主中定殖

本研究利用ARTP技术构建了Snodgrassella communis B10998菌株的输入突变体文库，通过优化暴露时间实现了高突变率（图1A，B）。为了探索促成定殖的遗传机制，在非本地宿主意大利蜜蜂（A. mellifera）中评估了突变体的定殖潜力，尽管突变体整体定殖水平低于野生型，但高剂量接种（图1C，D, E）和连续传代可提高其在宿主中的定殖能力（图1 F，G），暗示着突变可能有助于S. communis菌株提升在非本地宿主中的竞争优势。

图1. ARTP处理获得的Snodgrassella communis突变体在非本地宿主中的定殖

02

Snodgrassella菌株肠道定殖的潜在突变

通过研究在无菌蜜蜂模型体内连续传代下不同菌株基因的突变数量和频率（图2A），发现突变数量和平均突变频率并无显著变化。为了进一步评估不同蜂群中的突变模式，使用SnpEff工具对变异类型和功能进行了注释，发现SNPs是最普遍的突变类型，而插入突变只在D10组中发现（图2C），大多数突变为错义突变，可能会影响基因表达或蛋白质活性（图2D）。这些结果表明，Snodgrassella菌株肠道定殖的遗传变异在连续传代过程中保持稳定，突变的频率和模式没有显著变化。

图2. 体内传代过程中细菌的突变特征

03

mglB突变使细菌在非本地宿主中具有竞争优势

通过分析实验过程中出现的基因突变位置和频率，发现大部分的突变频率在5%到20%之间，并且没有特定的基因组位置偏向。特别地，rpsG和glcA突变在传代过程中以100%的频率保留下来（图3A）。此外，mglB点突变的频率在谱系2（P1L2）的第1代中仅为6.9%，但在第2代中迅速上升至100%，并在第3代中保持不变（图3B），这表明mglB突变可能为微生物肠道定殖带来竞争优势，通过PCR（图3C）和测序实验验证了这些突变的存在和频率，结果与预测结果高度一致。

图3 mglB中发生的点突变可能带来竞争优势

04

Snodgrassella菌株中的mgl操纵子

MglB是mgl操纵子的关键组成部分，对调节细菌的运动性至关重要。研究发现，从蜜蜂和大黄蜂中分离的S. communis菌株都发现了mgl操纵子，所有蜜蜂肠道S. communis菌株均含有三个mglB基因(图4A，B)。同时进一步确定了第3组中mgl操纵子的排列（图4C），表明mglB基因可能经历了重复或水平转移。

图4. Snodgrassella中的mgl操纵子

05

mglB的突变增强了适应性优势

研究人员探讨了S. communis菌株中mglB基因的错义突变对表型的影响，先前的研究表明，mglB基因在调节IV型菌毛依赖性细胞运动中起着重要作用，ΔmglB细胞会表现出改变的菌落形态和滑行运动能力。在菌落扩增试验中，SA01065突变体在0.5%琼脂上表现出与其他菌株完全不同的形态，形成了密集的树枝状结构，遍布培养基表面（图5E-F），这表明其细胞运动能力发生了改变，进一步强调了mglB中发现的突变会影响细胞运动能力。

研究团队还通过竞争实验探究了mglB基因突变对细菌在西方蜜蜂（A. mellifera）和地熊蜂（B. terrestris）宿主中的肠道定殖能力的影响。结果显示，即使在数量上处于劣势，SA01065突变体在蜜蜂宿主中仍能成功定殖（图5G，H），并且可以克服巨大的数量劣势并显著胜过背景突变体(SA01065')和野生型（WT）。

然而，在地熊蜂（B. terrestris）宿主中，即使SA01065突变体在接种物中的比例更高，SA01065'和野生型（WT）仍占据主导地位。此外还利用DNBSEQ-E25对扩增子进行测序确认了群落组成，结果与桑格测序一致，证实了SA01065突变体在非本地蜜蜂宿主西方蜜蜂（A. mellifera）中定殖的竞争优势，而在本地蜜蜂宿主地熊蜂（B. terrestris）中定殖的竞争优势并不明显。

图5. mglB突变会影响细胞运动能力和体内竞争优势

总结

本研究通过ARTP诱变技术获得肠道共生细菌突变体文库，并探究了这些变异基因在促进肠道细菌在蜜蜂宿主中定殖的分子机制，为未来研究肠道微生物和宿主的互作机制提供了新思路。其间，利用华大智造DNBSEQ-E25完成了部分肠道细菌群落检测实验，数据量充足，数据质量较高且与sanger测序结果一致。

DNBSEQ-E25是一款小巧轻便的基因测序仪，仪器占桌面积仅0.1 m2，运行速度快，对实验室环境要求低，安装、维护简便，大大降低了测序的门槛，适合开展病原微生物检测、宏基因组测序等应用。用户可根据研究对象选取扩增区域，设计引物进行扩增，再利用华大智造MGIEasy DNA文库制备试剂盒完成从扩增产物到测序文库制备的全流程，接头连接、文库扩增及一步法DNB制备的过程仅需3小时。

多重PCR扩增技术与高通量测序技术的融合，能够对样本中的微生物群落进行全面而深入的分析，为研究者提供强大的工具，以全面探索和理解微生物在健康、疾病以及生态系统中的作用。

参考文献：Meng Y, Zhang X, Zhai Y, et al. Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis[J]. Microbiome, 2024, 12(1): 93.