用户测评 | Mission Bio：华大智造MGISEQ-2000在 Tapestri 单细胞DNA和蛋白质文库测序中表现稳定

单细胞测序技术由于其在解析细胞异质性方面的突出优势，已广泛用于基础科研和医学研究，该技术对测序通量和数据质量有着较高要求。作为主流高通量测序平台的代表，华大智造MGISEQ-2000在单细胞测序应用领域中的测序表现受到业界关注。

高通量测序是在临床和科研应用中进行基因组学研究的金标准。本次测评通过在华大智造MGISEQ-2000和Vendor X两种测序平台上进行Tapestri单细胞DNA和蛋白质测序，比较两种测序平台对两种细胞系以约3:1比例混合的细胞中分析单细胞基因型和表型的能力。结果显示，两种测序平台在单细胞分析的每个级别（一级、二级和三级分析）都具有高度一致性。这表明，华大智造MGISEQ-2000测序平台可以用于使用Tapestri平台单细胞DNA变异和蛋白质表达谱分析。

测评方案

本次测评研究使用MGISEQ-2000测序仪和Vendor X测序平台对Tapestri单细胞DNA和蛋白质文库进行了测序（图1）。文库是从K562和RAJI细胞的3:1混合细胞中生成的，使用目录化MYE Panel，该Panel涵盖两种细胞系特有的遗传变异，研究中还按照标准操作程序添加针对蛋白表达检测的TotalSeq-D Heme Oncology Cocktail。基于华大智造MGISEQ-2000的测序实验在华大智造武汉客户体验中心实验室进行。

图1. 实验流程示意图

测评结果表1总结了测序后利用Tapestri Pipeline和Tapestri Insights进行数据处理和分析获得的关键性能指标。总体而言，这些指标在两个平台上高度一致。两个测序平台都产生了足够数量的总读序对，从而能够为下游分析提供强大的单细胞基因分型和表型分析。调用的细胞数量和Panel均一性在两个平台上也相当。此外，当使用Tapestri Pipeline处理数据时，华大智造测序平台的等位基因丢失率仅为6.7%，其关键性能指标再现了MYE Panel数据表1中呈现的指标，表明华大智造MGISEQ-2000适合对Tapestri单细胞文库进行测序。

表1. 一级、二级和三级分析结果比较

为了确定每个平台是否可以成功识别细胞系及其各自的遗传变异，本次研究对数据（基因型）进行聚类并通过热图将其可视化（图2）。该分析揭示了两个细胞群，K562细胞和RAJI细胞，比例约为3.5：1，在输入细胞比例的预期范围内。在两个测序平台上（图2A和2B），两个群体都以高度可比的比例被轻松鉴定。使用四个不同基因（TET2，SETBP1，CLB，KIT）的细胞系特异性变异确认了这些细胞群体的身份。所有四个变体的总体突变分布在两个测序平台之间显示出相同的模式，从而显示出成功调用单细胞基因型方面的相同性能。

图2.使用选定突变的基因型数据进行分层聚类

（A）在Vendor X平台上根据细胞系特异性突变的四个变体（列）对所有细胞进行聚类后的热图，得到K562和RAJI细胞~3.5：1分离和鉴定。（B）在MGISEQ-2000上根据细胞系特异性突变的四个变体（列）对所有细胞进行聚类后的热图，得到K562和RAJI细胞的~3.5：1分离和鉴定。

除了基因分型数据外，蛋白质表达数据上也表明两种测序平台具有高度一致性。在已知在RAJI和K562细胞中差异表达的选定数量的谱系标记物上，以~1:3的比例检测到两种细胞系（图3）。具体而言，检测到CD30在K562细胞中高表达，在RAJI中很难被检测到，而HLA_DR、B细胞标志物CD19和CD38在B淋巴细胞系RAJI中高表达，在K562中检测不到。CD71在两种细胞系中均有表达，但在K562细胞中与RAJI相比显着更高。

图3. 区分K562和RAJI细胞的单细胞蛋白质表达数据

注：已知在两个细胞系中差异表达的五个标记物的标准化表达数据的分层聚类1-3。两个测序平台上基于细胞条形码整合后的数据聚（左）或分别基于两台测序仪的数据进行分析（右）。

最后，利用标准化蛋白质表达数据进行UMAP降维聚类，结果证实两种测序平台上两种细胞系被成功鉴定和分离（图4A），并在整合基因分型数据时确认两组不同的细胞分别属于RAJI或K562（图4B）。

4. 可视化结果整合图（A）基于标准化后的蛋白表达数据进行UMAP分析在两个测序平台（左）或单个平台（右）中所有细胞的聚类情况，颜色代表不同的测序平台（左）或不同细胞系（右）。（B）基于四种选定细胞系特异性变异的等位基因频率（VAF）绘制其在UMAP图上的投影。

测评总结

华大智造MGISEQ-2000高通量测序平台在Tapestri细胞DNA和蛋白质文库测序中表现稳定，实现准确的DNA变异鉴定、蛋白质表达水平定量和亚克隆鉴定，可满足用户的各项需求。同时，依托其快速、灵活、高通量的平台优势，华大智造MGISEQ-2000广泛适用于全基因组测序、超深度外显子组测序、表观基因组测序、转录组测序和肿瘤Panel等大型测序项目。

参考文献：1. Lee K. et al., CD30-Redirected Chimeric Antigen Receptor T Cells Target CD30+ and CD30– Embryonal Carcinoma via Antigen-dependent and Fas/FasL Interactions. Cancer Immunol Res, 6(10):1274-1278 (2018).

2. M. Tommy et al., Crosslinking of CD38 Receptors Triggers Apoptosis of Malignant B Cells. Molecules, 26(15):4658 (2021).

3. Sebastian et al., A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. Oncoimmunology, 3(8): e954893 (2014).